Источник: http://laboratoria.khv.ru/


 Вирус иммунодефицита человека -ВИЧ, Human immunodeficiency virus - HIV 

Строение ВИЧ, антигенный состав

I. Выявление антител к ВИЧ

Метод иммуноферментного анализа

Иммунный блоттинг

Метод непрямой иммунофлуоресценции

Радиоиммунопреципитация 

Метод агглютинации

II. Обнаружение антигенов ВИЧ

III. Выделение вируса.

Метод культуральной    диагностики

Молекулярно-биологические методы.

IV. Выявление иммунологических нарушений.

Употребляя термин "СПИД", не все знают, что это не самостоятельное заболевание, а терминальная стадия ВИЧ-инфекции -  инфекции, вызванной Вирусом Иммунодефицита Человека

Вирус иммунодефицита человека -ВИЧ, Human immunodeficiency virus - HIV 

ВИЧ  принадлежит к семейству Retriviridae, подсемейству Lentivirus. Это ретровирус, используя фермент обратную транскриптазу,трансформирует свой РНК-геном в ДНК, которую встраивает в гены клетки-хозяина. По сути, хозяином теперь становится ВИЧ, потому что новые клетки, получаемые в результате деления заражённой, уже несут в себе вирусные гены. Оправдывая своё название (Lentivirus - "медленный" вирус), ВИЧ никуда не спешит - инкубационный период) до появления симптомов болезни) длится от нескольких месяцев до 8 - 10 лет (у 2/3 инфицированных лиц на протяжении 5 лет не было никаких симптомов СПИДа). Раньше ВИЧ-инфекция проявляет себя, будучи переданной при переливании крови, а также - при ослабленном иммунитете хозяина (наркомания и гомосексуализм не только увеличивают риск заражения, но и являются факторами подавления иммунитета). 

ВИЧ разрушает Т4-лимфоциты ("хелперы" - помощники клеточного иммунитета), а также уничтожает макрофаги.  Как следствие нарушается иммунологический баланс - возрастает активность Т -лимфоцитов "супрессоров", подавляющих клеточный иммунитет. Развивается иммунологическая недостаточность - организм оказывается не в состоянии бороться  с простейшими инфекциями, не говоря уже о грозных. "В рост" идут дремлющие в организме многих из нас инфекции - герпетическая, цитомегаловирусная, грибковые - кандидоз, криптококкоз, прогрессирует туберкулёз, паразитарные заболевания - токсоплазмоз, амебиаз, пневмоцистная пневмония. Снижение клеточного иммунитета ведёт к возникновению опухолей, прежде всего - саркомы Капоши. 

Атака Т-лимфоцита вирусами иммунодефицита человека (HIV)

Следует отметить, что верными помощниками ВИЧ-инфекции являются практически все возбудители ИППП, присутствующие в нашей галерее, с другой стороны, ВИЧ создаёт благоприятнейшие условия для заражения этими инфекциями.

HIV на поверхности Т-лимфоцита. ТЭМ, х 210.000. Условные цвета.

Существует два типа ВИЧ: ВИЧ-1 и ВИЧ-2. Вторым заражаются реже, он имеет больший инкубационный период. Тем не менее обольщаться относительно "безопасности" ВИЧ-2 не стоит.  Вирус ВИЧ находится в крови, сперме, вагинальном секрете. 

Медицинская инъекционная игла со следами крови. СЭМ, х125

Поэтому заражение возможно там и тогда, где и когда эти биологические жидкости могут попасть в кровь другого человека. Так, в России в настоящее время заражение чаще всего происходит в среде употребляющих наркотики при повторном использовании загрязнённого кровью шприца. 

Вирусы иммунодефицита (HIV) присоединяются к гликопротеиновым рецепторам на поверхности лимфоцита. Электронная микроскопия. Условные цвета.

Первые симптомы ВИЧ инфекции неспецифичны: "немотивированное" повышение температуры тела, слабость, потливость, повышенная утомляемость, головная боль, кашель, расстройство стула, похудание, увеличение печени, селезёнки и лимфоузлов. Дальнейшие проявления зависят от сочетания многочисленных  и разнообразных инфекций, развивающихся на фоне СПИДа.

  Вирусы иммунодефицита (HIV) присоединяются к гликопротеиновым рецепторам на поверхности лимфоцита. СЭМ х 110.620. Условные цвета.

Строение ВИЧ, антигенный состав*

* этот "заумный" материал может оказаться весьма полезным, а иногда и необходимым  далее, при выяснении преимуществ и недостатков различных методов диагностики ВИЧ. Кроме того, он незаменим при самостоятельной "расшифровке" результатов анализов

Строение ВИЧ, его антигенный состав

На поверхности ВИЧ присутствуют многочисленные выступы, состоящие из белково-полисахаридных комплексов - гликопротеинов. Именно от них зависит способность вируса присоединяться к Т4 рецепторам на поверхности лимфоцитов, проникать в них и разносится с лимфоцитами по всему организму.  

В конусовидной сердцевине вируса находятся тяжи РНК - геном вируса. Основными структурными генами ВИЧ, кодирующими трансляцию белков, из которых в последующем строится вирус, являются gag (group — specificantigens), pol (polymerase), env (envelope).  

К регуляторным генам относятся: tat (трансактиватор всех вирусных белков), rev (регулятор экспрессии вирионных белков), vif (вирионный инфекционный фактор), vpr (функции остаются неясными), nef (негативный фактор экспрессии), vpx (функции неизвестны). Ген gag кодирует белки сердцевины. Первичным продуктом трансляции этого гена является белок-предшественник р53, подвергающийся расщеплению двумя путями. При одном варианте расщепления из белка-предшественника образуется 3 структурных белка сердцевины: р15, р17, р24. Другой вариант предполагает образование промежуточного белка р39, который расщепляется на белки р17 и р24. В сыворотке крови большинства инфицированных ВИЧ выявляются антитела к этим антигенам. Обычно антитела к р24 обнаруживаются на ранней стадии ВИЧ-инфекции, причем белок р24 является более иммуногенным, чем р17. Ген pol кодирует белки р51/66 и р31, которые представляют собой обратную транскриптазу и эндонуклеазу ВИЧ .

Наиболее иммуногенными белками вирусной частицы, как и других известных форм вирусных инфекций, являются поверхностные гликопротеины gp 160/120, а также трансмембранный белок gp 41, которые кодируются геном env. Антитела к белкам, кодируемым геном env, появляются относительно рано, выявляются у 98% инфицированных и более стабильны, чем антитела к другим антигенам. Антитела к основным внутренним белкам ВИЧ (р17 и р24) выявляются примерно у 75% инфицированных и не чаще, чем у 50% больных с клинически выраженным СПИДом . Роль регуляторных белков и их серологическая активность нуждаются в дальнейшем изучении.

 

СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ И ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ 

При болезнях с длительным инкубационным периодом и разнообразной клинической симптоматикой, одной из которых является СПИД, исключительно велика роль лабораторных методов диагностики. Существует несколько методов лабораторной диагностики СПИДа: выделение вируса, выявление антител к ВИЧ, обнаружение антигенов или других компонентов ВИЧ, выявление иммунологических нарушений.

 

Установлено, что ДНК ВИЧ может находиться в геноме человека как минимум три года без признаков активности и антитела к ВИЧ (по которым его и обнаруживают) не появляются. Это один из примеров  сложности проблемы СПИДа - ведь при переливании крови, клетки которой несут такой "спящий" вирус, вполне возможно заражение. Но всё же типичной является ситуация, когда организм начинает вырабатывать антитела через 6 - 12 недель, реже - через 8 месяцев после инфицирования.

I. Выявление антител к ВИЧ в сыворотке крови - наиболее распространенный прием в лабораторной диагностике ВИЧ-инфекции. Хотя положительный результат исследования при определении антител к ВИЧ не является окончательным критерием оценки состояния и прогноза болезни, он дает возможность с достаточной долей вероятности установить факт инфицирования. Данный вид диагностики обладает достаточно высокой чувствительностью, однако далеко не 100% специфичен из-за возможности получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Это происходит из-за того, что в инфицированном организме на разных стадиях болезни продуцируются и персистируют антитела к различным структурным и регуляторным белковым компонентам ВИЧ (описание последних см. выше). ля выявления антител к ВИЧ чаще всего используют метод иммуноферментного анализа (ИФА). При проведении ИФА в 3 — 5% случаев возможны ложноотрицательные результаты -  если инфицирование произошло относительно недавно и уровень антител еще очень низкий, или в терминальной стадии болезни, характеризующейся тяжелым поражением иммунной системы с глубоким нарушением процесса антителообразования. Поэтому при наличии данных, свидетельствующих о контакте с инфицированными ВИЧ  обычно проводят повторные исследования через 2 - 3 мес. Но даже при повторных исследованиях удается выявить не всех инфицированных лиц, так как существуют сероотрицательные носители ВИЧ, т.е. те, у которых антитела не вырабатываются в течение очень длительного времени. В США количество таких ложноотрицательных исследований составляет около 1% в год. Причиной ложноположительных результатов ("обнаружению" ВИЧ там, где его нет) при постановках ИФА является наличие у пациентов аутоиммунных процессов, антител к ревматоидному фактору, вирусу Эпштейна - Барр, молекулам главного комплекса гистосовместимости. Частота ложноположительных результатов при использовании различных тест-систем (разных диагностических наборов) колеблется от 0,02 до 0,5%. Число ошибочных результатов можно значительно снизить при использование в качестве антигена рекомбинантных белков ВИЧ. Чувствительность и специфичность тест-систем для ИФА в этом случае можно сравнить с иммунным блоттингом. 

Иммунный блоттинг (иммуноблот, Western Blot, вестерн-блот) - сочетает в себе иммуноферментный анализ (ИФА) с предварительным электрофоретическим переносом на нитроцеллюлозную полоску (стрип) антигенов вируса. Иммуноблот (ИБ) включает в себя несколько стадий. Подготовка стрипа. Предварительно очищенный и разрушенный до составных компонентов вирус иммунодефицита (ВИЧ) подвергается электрофорезу, при этом входящие в состав ВИЧ антигены разделяются по молекулярному весу. Затем методом блоттинга (аналог выдавливания на "промокашку" избытка чернил) антигены переносят на полоску нитроцеллюлозы, которая отныне содержит невидимый пока глазом спектр антигенных полос, характерный для ВИЧ.  Исследование пробы. На нитроцеллюлозную полоску наносится исследуемый материал (сыворотка, плазма крови пациента и т.п.), и если в пробе есть специфические антитела, то они связываются  со строго соответствующими им (комплиментарными)  антигенными полосами. В результате последующих манипуляций результат этого взаимодействия визуализируется - делается видимым. Трактовка результата. Наличие полос в на определённых участках нитроцеллюлозной пластины подтверждает присутствие в исследованной сыворотке антител к строго определённым антигенам ВИЧ. 

ВИЧ Western Blot - тест-система фирмы Organon Teknika для определения антител к ВИЧ в сыворотке и плазме крови.

Полоски-стрипы из блота. Чтение результатов.

В положительном  контроле и исследуемом образце присутствуют полосы:

gag p17, p24, p55 (оболочка)
pol p31 (эндонуклеаза), p51, p65 (обратная транскриптаза)
env gp 41 (трансмембранный белок)

gp120, gp 160 (поверхностные структуры)

  • Полоска А - Положительный контроль

  • Полоска В - Слабоположительный контроль

  • Полоска С - Отрицательный контроль

  • Полоска D - Положительный образец (обнаружено присутствие антител к ВИЧ-1)

В настоящее время ИБ является основным методом для подтверждения наличия вирусспецифических антител в исследуемой сыворотке. В некоторых случаях ВИЧ-инфекции, до развития сероконверсии, специфические антитела более эффективно выявляются методом ИБ, чем ИФА. При исследовании методом ИБ обнаружено, что чаще всего в сыворотках больных СПИДом выявляются антитела к gp 41, причем обнаружение р24 у лиц, обследуемых с профилактической целью, требует дополнительных исследований на наличие у них ВИЧ-инфекции. Тест-системы для ИБ на основе рекомбинантных белков, полученных путем генной инженерии, оказались более специфичными, чем обычные системы на основе очищенного вирусного лизата . При использовании рекомбинантного антигена формируется не диффузная, а четко выраженная узкая полоска антигена, легко доступная для учета и оценки.

Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ, 1991) рекомендует следующую оценку результатов исследований, проведенных методом ИБ: 

Положительный результат — обнаружение в сыворотке антител к двум вирусным белкам из группы env с наличием или отсутствием белков — продуктов других структурных генов (gag, pol); 

Отрицательный результат — отсутствие антитела к вирусспецифическим белкам; 

Неопределенный результат — обнаружение в сыворотке антител к белкам из групп gag, pol.

Как правило, неопределенная реакция в ИБ связана с наличием белков — продуктов экспрессии гена gag ВИЧ-1 р15/17, р24 и р55, что может свидетельствовать как о ложноположительной реакции, так и о возможности инфицирования ВИЧ-1. 

 

Для выявления антител у инфицированных ВИЧ применяют также ряд других методов:  иммунофлуоресценцию, радиоиммунопреципитацию, агглютинацию.

Метод непрямой иммунофлуоресценции относительно прост при наличии люминесцентного микроскопа и квалифицированного персонала, способного проводить учёт результатов. В качестве антигенов в этой реакции используются различные клеточные линии, инфицированные ВИЧ (MOLT, H9, СЕМ, HUT-78 и др.).

Радиоиммунопреципитация  является наиболее чувствительным методом выявления антител к ВИЧ и может использоваться как метод экспертной диагностики при неопределенных результатах ИБ. В основе метода лежит использование белков ВИЧ, меченных радиоактивным йодом. Не получил широкого распространения из-за необходимости применения радиоактивных материалов и специального оборудования. К тому же для постановки реакции нужно культивировать инфицированные вирусом клетки. Поэтому радиоиммунопреципитация применяется  преимущественно в научно-исследовательских лабораториях.

Метод агглютинации является одним из наиболее простых, чувствительных и специфичных для определения антител к ВИЧ. Он не требует специального оборудования, необходим лишь некоторый опыт в интерпретации результатов.

II. Обнаружение антигенов ВИЧ в исследуемом материале основано главным образом на тех же принципах, что и выявление антител, но с некоторыми модификациями. В связи с низким содержанием антигенов в крови, а также тем, они циркулируют в виде иммунных комплексов чувствительность составляет, в среднем,  60%. Поэтому иммуноферментные диагностикумы на антигены ВИЧ, в основном, используются только для экспериментальных и научно-исследовательских целей.

 

III. Выделение вируса.

Метод культуральной диагностики ВИЧ-инфекции широко не используется, хотя обладает высокой специфичностью. Он требует соблюдения особых условий безопасности, дорогостоящих и дефицитных сред, значительных затрат времени, и, кроме того, по данным некоторых исследователей, чувствительность метода колеблется от 25 до 75%.

Молекулярно-биологические методы. Успехи в развитии молекулярной биологии позволили вывести прямое выявление возбудителей инфекций на принципиально новый качественный уровень. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) благодаря высокой чувствительности, специфичности, воспроизводимости  в настоящее время широко используется в биотехнологии, генетике, судебной медицине, для диагностики генетических и вирусных заболеваний, в том числе и ВИЧ-инфекции. Данный метод позволяет обнаружить геном ВИЧ, встроенный в геном пораженных лимфоцитов. Это возможно при наличии вирусных генов всего в 1 из 5000 клеток, даже в период отсутствия в крови антител или при недостаточном их уровне для обнаружения существующими стандартными методами. Так как методом ПЦР определяют не антитела к продуктам генов ВИЧ, а непосредственно генетические структуры, он незаменим при диагностике ВИЧ-инфекции в серонегативный период, у детей, рожденных ВИЧ-инфицированными матерями (персистенция материнских антител у ребенка может достигать 15 мес.), при неопределенных результатах ИБ, одновременной диагностике множественных инфекций, встречающихся при СПИДе, дифференциальной диагностике между ВИЧ-1, ВИЧ-2 и другими вирусными заболеваниями, определении соотношения между клеточным и внеклеточным вирусом, при испытаниях на животных химиопрепаратов и вакцин против СПИДа, исследовании банков крови и препаратов из крови. 

 В качестве материала для исследования в ПЦР может быть использована ДНК, выделенная не только из свежеполученных клеток и тканей, но и из замороженных, высушенных или фиксированных препаратов, имеющих частично разрушенные нуклеиновые кислоты. 

Главным недостатком метода является дороговизна оборудования и реактивов для его проведения, но в конечном счете применение ПЦР экономически выгодно, так как значительно снижает количество стадий и продолжительность исследований на ВИЧ-инфекцию. Метод ПЦР удобен для изучения и диагностики ВИЧ-инфекции, особенно в тех случаях, когда серологические тесты или культивирование вируса затруднены или малоэффективны. Вместе с тем нельзя не отметить возможность получения при проведении ПЦР ложноположительных реакций.

Таким образом, современные методы лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции позволяют с достаточной степенью надежности проводить исследования по определению антител к ВИЧ и идентификации его компонентов. Однако постоянная изменчивость вируса, не имеющая аналогов по сравнению с изменчивостью других известных вирусов человека, создает риск получения в исследованиях ложноотрицательных результатов. Поэтому используемые в практической работе для диагностики ВИЧ-инфекции методы требуют постоянного совершенствования.

 

IV. Выявление иммунологических нарушений. Известно, что в основе развития СПИДа лежит, в первую очередь, разрушение Т-лимфоцитов-хелперов, маркируемых моноклональными антителами ОКТ4+ (CD4). В связи с этим проведение диагностики и наблюдение за прогрессированием заболевания невозможно без контроля субпопуляции Т-хелперов, который наиболее удобно осуществлять с помощью лазерного клеточного сортировщика. При слабо выраженной ВИЧ-инфекции количество Т-лимфоцитов - чрезвычайно вариабельный показатель. В целом, снижение числа клеток OKT4+ (абсолютное и относительное) обнаруживается у лиц, ВИЧ-инфицирование которых  произошло не менее года назад, С другой стороны, на ранних стадиях инфекции нередко оказывается резко повышенным число OKT8+ (CD8, Т-супрессоры)  как в периферической крови, так и в увеличенных лимфоузлах.

При выраженном СПИДе абсолютное большинство больных имеет сниженное общее число Т-лимфоцитов (менее 1000 в 1 мкл крови, в том числе лимфоцитов OKT4+  -  менее чем 22 в 1 мкл, тогда как абсолютное значение содержания ОКТ8+ остаётся в пределах нормы). Соответственно, резко снижается соотношение ОКТ4+/ОКТ8+. Ответ Т-лимфоцитов in vitro на стандартные антигены и митогены снижается в строгом соответствии с относительно сниженным числом OKT4+.

Для поздних стадии СПИДа характерны общая лимфопения, нейтропения,  тромбоцитопения ( соответственно, снижение числа лимфоцитов, нейтрофилов и тромбоцитов), анемия. Эти изменения могут быть следствием центрального угнетения кроветворения за счёт поражения кроветворных органов вирусом, а также - аутоиммунного разрушения клеточных субпопуляции на периферии. Кроме того, для СПИДа характерно умеренное увеличение количества гамма-глобулинов с доминирующим увеличением содержания IgG. Больные с выраженными симптомами СПИДа нередко имеют повышенный уровень IgA.  На некоторых стадиях заболевания существенно повышается уровень таких маркёров СПИДа, как β1-микроглобулин, кислотостабильный α-интерферон, α1-тимозин. То же происходит с секрецией свободного неоптерина — метаболита макрофагов. Пока не представляется возможным оценить относительную значимость каждого из перечисленных тестов, число которых постоянно возрастает. Поэтому их следует рассматривать во взаимодействии с маркёрами ВИЧ-инфекции как иммуновирусологического, так и цитологического характера.

Для клинического анализа крови характерны лейкопения, лимфопения (соответственно, снижение числа лейкоцитов и лимфоцитов). Важный иммунологический симптом СПИДа - аллергия, выявляющаяся при постановке разнообразных кожно-аллергических проб, например, с туберкулином. При подозрении на иммунную недостаточность ставят кожный тест гиперчувствительности замедленного типа с туберкулином (реакция Манту). В случае отрицательного результата исследование продолжают и определяют реактивность лимфоцитов в культуре на конканавалин А или фитогемагглютинин. Если индекс стимуляции клеток > 15 при положительной туберкулиновой пробе, подозрение снимается. При отрицательной реакции на туберкулин и индексе стимуляции <15 диагностический поиск продолжают. В последующем определяют ОКТ4+ клетки (CD4, Т-хелперы). Если их меньше 400 в 1 мкл цельной крови и соотношение ОКТ4+ к ОКТ8+ равно 1, то вполне обоснованно ставится диагноз СПИДа. При содержании  Т-хелперов >400 в 1 мкл крови и соотношение ОКТ4/OKT8 (вспомогательных клеток и супрессоров) более 1,  диагноз ставится под сомнение.

 


Словарик